В конце 1980-х годов, как передовая, лазерная конфокальная микроскопия имеет большой недостаток: конфокальная апертура не только блокирует флуоресценцию, генерируемую вне фокальной точки, но также блокирует флуоресценцию, генерируемую фокальной точкой, которая рассеивается биологическими тканями. что приводит к снижению эффективности сбора флуоресценции, а глубина визуализации не может быть более 100 микрометров. Поэтому в 1990-х годах появилась двухфотонная флуоресцентная микроскопия, сочетающая лазерную конфокальную микроскопию и технологию двухфотонного возбуждения. Длина волны возбуждения процесса двухфотонного поглощения обычно устанавливается в диапазоне биооптического окна 680-1080 нм, что позволяет избежать повреждения клеток или живых организмов ультрафиолетовым светом и проникает глубже.
В настоящее время наиболее широко используемым двухфотонным флуоресцентным микроскопом является фемтосекундный лазер на титановых драгоценных камнях, который является громоздким и дорогим, что ограничивает применение двухфотонной флуоресцентной микроскопии в различных областях, таких как науки о жизни, химия и медицина. Поэтому в некоторых областях, таких как медицинская диагностика, в качестве стандартного источника света пытались использовать компактные и доступные субнаносекундные твердотельные лазеры.
Основной принцип двухфотонного возбуждения заключается в том, что когда флуоресцентная молекула возбуждается при высокой плотности фотонов, она одновременно поглощает два длинноволновых фотона, а затем спонтанно излучает флуоресцентные фотоны обратно в основное состояние после скачков возбуждения и процессов релаксации. По сравнению с обычной флуоресцентной микроскопией с однофотонным возбуждением генерация оптического сигнала в флуоресцентной микроскопии с двухфотонным возбуждением является нелинейной, при этом возбуждающий свет представляет собой источник света с большей длиной волны и более высокой пиковой мощностью, а испускаемые флуоресцентные фотоны имеют длину волны немного длиннее половины длины волны возбуждения.
В двухфотонной флуоресцентной микроскопии используется лазерный источник света ближнего инфракрасного диапазона, и его нелинейный характер не требует конфокальной апертуры. Таким образом, по сравнению с конфокальной микроскопией двухфотонная флуоресцентная микроскопия имеет следующие преимущества:
- Большая глубина изображения и низкий уровень оптических повреждений;
- Конфокальная апертура не требуется, а эффективность сбора флуоресценции значительно повышается;
- Более высокое пространственное разрешение и контрастность;
- Малый диапазон возбуждения, малая фототоксичность и обесцвечивание;
- Длины волн излучения и возбуждения далеко друг от друга, что позволяет избежать спектрального перекрытия;
